La segunda sala presenta esculturas románicas y alguna pieza ya gótica, aunque está  presidida por el lienzo de la Inmaculada Niña, obra de Francisco Zurbarán, que muestra a María, en su Concepción Inmaculada, siguiendo la determinación iconográfica que hizo Francisco Pacheco por encargo de la Iglesia en 1630. Apenas una muchacha de doce años, con su vestido blanco y su manto azul, la luna a los pies, bañada de sol y coronada por las doce estrellas, tal como la describe el capítulo doce del libro del Apocalipsis. Y cerrando el cuadro en la parte inferior una visión idealizada de Sevilla, para presentar los símbolos de las letanías lauretanas.

La sala se abre, en la contraportada del segundo de los arcos mudéjares, con dos imágenes románicas, santa María Magdalena y santa Águeda,  y al frente, escoltando a la Inmaculada Niña dos bellísimas cruces parroquiales, de bronce, de finales del siglo XIII o del recién iniciado XIV. Muestra además un  Rey Mago, a caballo entre los siglos XII y XIII, una espléndida colección de imágenes de la Virgen de los siglos XII al XIV con nombres como Nuestra Señora de la Sopeña o  del Buen Consuelo, la talla popular de la Huída a Egipto y la representación en alabastro de Adán y Eva a ambos lados del paso a la sala tercera.